LABORATORIO DE GENÉTICA
Los seres humanos tenemos unos 30,000 genes distintos, dispuestos en estructuras con aspecto de carretes de hilo llamados cromosomas. Heredamos nuestros cromosomas de nuestros padres, 23 de nuestra madre y 23 de nuestro padre, de manera que tenemos dos juegos de 23 cromosomas, o 23 “pares” de cromosomas. Valga como símil considerar el código genético como el libro de la vida, en el que el ADN está representado por letras, los genes son las palabras y los cromosomas, los capítulos de dicho libro. Figura 1: Genes, cromosomas y 2 (aunque una buena parte del análisis está automatizado, el genetista revisa todo el proceso). Con frecuencia se repite el análisis para confirmar el resultado. También existen métodos que garantizan que no ha habido confusión o mezcla de muestras. Muchos laboratorios participan en programas de Control de Calidad, lo que contribuye a la realización de análisis genéticos fiables y de calidad.
Laboratorios de Genética
1) Citogenética
La citogenética es el campo de la genética que comprende el estudio de la estructura, función y comportamiento de los cromosomas. Incluye análisis de bandeado G en cromosomas, otras técnicas de bandeado citogenético, y también la citogenética molecular del tipo de hibridación por fluorescencia in situ (FISH) e hibridación por genómica comparativa (CGH).
Historia
Primeros años
Los cromosomas fueron observados por primera vez en células vegetales por Karl Wilhelm von Nägeli en 1842. Su comportamiento en células animales (de salamandra) lo describió Walther Flemming, el descubridor de la mitosis, en 1882. Otro anatomista alemán, von Waldeyer, le dio nombre en 1888.
La siguiente etapa tuvo lugar tras el desarrollo de la genética a principios del siglo XX, cuando se dedujo que el conjunto de cromosomas (el cariotipo) era quien portaba los genes. Levitsky parece que fue el primero que definió el cariotipo como la apariencia fenotípica de los cromosomas somáticos, en contraste con su contenido genético. La investigación del cariotipo humano llevó muchos años para responder a la pregunta más básica: ¿cuántos cromosomas tiene una célula diploide humana normal? En 1912, Hans von Winiwarter recopiló 47 cromosomas en espermatogonias y 48 en oogonias, concluyendo con un mecanismo de determinación sexual XX/XO. Painter en 1922 no estaba seguro de que el número diploide del hombre fuera 46 o 48, a favor de 46. Cambió su opinión más tarde de 46 a 48, e insistió de manera acertada en que el hombre tenía un sistema XX/XY. Considerando sus técnicas, estos resultados fueron bastante destacables.
Se necesitaban nuevas técnicas para resolver definitivamente el problema:Utilizando células en cultivoPretratando células en un medio hipotónico, el cual penetra y dispersa los cromosomasDetener la mitosis en metafase con una solución de colchicinaAplastando la preparación para forzar a los cromosomas a ponerse en un mismo planoTroceando una fotomicrografía y organizando el resultado en un cariograma indiscutible.
Hasta mediados de los años 50 no fue generalmente aceptado que el cariotipo del hombre incluía sólo 46 cromosomas. Y algo muy importante, los grandes primates tenían 48 cromosomas.
Anomalías numéricas humanas
Con la aparición de procedimientos que permitían enumerar los cromosomas de forma sencilla, inmediatamente se hicieron descubrimientos en relación a anomalías que derivan de los casos de no disyunción los cuales provocan la aparición de aneuploidías (adiciones o deleciones de cromosomas enteros). En 1959, Lejeune[14] encontró que los pacientes con síndrome de Down tenían una copia extra del cromosoma 21. El síndrome de Down es conocido también como trisomía del 21. En 1960, Nowell[15] descubrió un pequeño cromosoma, denominado el cromosoma Filadelfia, el cual se demostró que era la causa de la Leucemia mieloide crónica. 13 años más tarde Janet Rowley probó que se trataba de una translocación de los cromosomas 9 y 22.
Otras anomalías cromosómicas descubiertas incluyen anomalías en cromosomas sexuales. Un individuo que sólo posea un cromosoma sexual (el X) padece el síndrome de Turner, un cromosoma X de más en un varón, con 47 cromosomas en total, padece el Síndrome de Klinefelter. Muchas más combinaciones pueden aparecer sin ser letales como XXX, XYY, y XXXX. La capacidad de los mamíferos para tolerar aneuploidías en cromosomas sexuales deriva de la capacidad de inactivarlos, que se necesita en hembras normales para compensar el tener dos copias del X. No todos los genes del cromosoma X se inactivan, lo que responde a por qué se observa una diferencia fenotípica en individuos con un cromosoma X de más o de menos.
La trisomía del 13 se relaciona con el Síndrome de Patau y la del 18 con el Síndrome de Edward.
2) Genética molecular
Ante la sospecha de una enfermedad de base genética causada por una mutación en un determinado gen, el médico solicita una prueba consistente en el análisis de dicho gen al laboratorio de genética molecular. Las instrucciones contenidas en el ADN están codificadas mediante cuatro letras: A, C, G y T. En el laboratorio de genética molecular se buscan “errores de ortografía” en la secuencia de un gen en particular. Un gen puede consistir en una secuencia de 10,000 letras o más de código de ADN. El trabajo del genetista consiste en leer el código y encontrar posibles cambios que puedan interferir en las instrucciones que necesita el organismo, y por tanto causar la enfermedad. 6 A diferencia de los cromosomas, el ADN no puede examinarse directamente con un microscopio. El genetista molecular extrae el ADN de las células y lo usa para preparar reacciones químicas que permiten leer el código del gen de interés. Existen muchas técnicas distintas para identificar mutaciones. La secuenciación es una de las más comunes.
Microarray CGH.
Esta nueva tecnología implementada como contribución al Cariotipo Molecular, permite la detección de aberraciones cromosómicas complejas, reordenamientos cromosómicos crípticos, microdeleciones o microduplicaciones de menos de 1 megabase (Mb), como responsables de las principales afecciones genéticas de nuestra población.
El análisis e interpretación de resultados se realiza en nuestro laboratorio, utilizando la plataforma de microarrays SurePrint G3 Unrestricted CGH ISCA v2, en matrices de 8 × 60K. Esta plataforma contiene aproximadamente 60.000 sondas CGH de 60pb que abarcan todo el genoma humano con una cobertura mayor de sondas en regiones subteloméricas, regiones de microdeleciones/duplicaciones, genes conocidos de haploinsufiencia y regiones asociadas a discapacidad intelectual ligada al X, pudiendo detectar desbalances desde 25 Kb en dichas regiones. Así este tipo de análisis genómico se ha convertido en una poderosa herramienta diagnóstica, de uso pre y post natal, pudiendo detectar alteraciones genómicas que escapan al análisis convencional. Para un mejor análisis e interpretación de resultados mCGH, es necesario conocer las características clínicas del paciente que deben ser informadas en una Ficha (adjunta) y enviada al laboratorio junto con la muestra del paciente.
Diagnóstico de mutaciones del gen FMR1, Síndrome X frágil (SXF).
Hoy día las nuevas aproximaciones al diagnóstico molecular del SXF nos permiten definir mejor el tipo de alteraciones que producen el SXF y los trastornos asociados: Temblor y Ataxia (FXTAS) y Falla Ovárica Prematura (FXPOI). Además de los métodos de diagnóstico tradicionales PCR y Southern Blot, contamos con el test Amplidex®, desarrollado con tecnología de Asuragen, con mayor sensibilidad que el Southern blot. Este método consiste en una reacción de PCR, a partir de ADN extraído desde la muestra de sangre del paciente, luego en el secuenciador de Applied Biosystems se determina el tamaño del fragmento obtenido y a partir de ese tamaño se determina el número de repetidos CGG (Figura 2). La ventaja de esta metodología es que permite detectar hasta 1300 repeticiones CGG y las interrupciones AGG, fundamentales al momento de asesorar a las familias sobre los riesgos de dicha expansión.
Test de Metilación, Síndromes de Prader Willi (SPW) y Angelman (SA).
El Test de Metilación es la primera aproximación que se debe utilizar en el diagnóstico de los SPW y SA. Este método está basado en un PCR sensible a la metilación, a partir del segmento cromosómico 15q11-13. Previo al PCR se realiza la modificación del ADN del paciente por Bisulfito, de manera tal que en las personas normales se obtienen dos productos de PCR uno que corresponde al alelo materno metilado y el otro al alelo paterno no metilado. En los casos de SPW se detecta sólo el alelo materno y en el SA se observa sólo el alelo paterno.
MLPA (Amplificación Múltiple de Sondas Dependientes de Ligación)
Es un método de PCR múltiple que permite a través de un análisis cuantitativo detectar cambios en el número de copias de uno o más exones de un gen o genes asociados a ciertas patologías. Los productos de amplificación resultantes de cada SALSA MLPA oscilan entre 130 y 480 nt de longitud y son analizados por electroforesis capilar. Al comparar el patrón de picos obtenido de la muestra en estudio con las muestras de referencia, es posible determinar las secuencias que muestran números de copias alterados. Así MLPA permite identificar aberraciones en genes únicos que son demasiado pequeños para ser detectados por FISH y que son la causa de desórdenes genéticos frecuentes como: CMTA1 Charcot Marie Tooth 1A, HNPP (Neuropatía hereditaria sensible a la presión), Rearreglos subteloméricos y otras.
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